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Externes Peer-Review des RT-PCR-Tests zum Nachweis von SARS-CoV-2 offenbart 10 wesentliche wissenschaftliche Mängel auf molekularer und methodischer Ebene: Konsequenzen für falsch positive Ergebnisse.

Lieber Leser heute fangen wir mal mit einem Zitat von Prof. Albert Einstein an, (aus einer Rundfunksendung für United Jewish Appeal, 11. April 1943):

„Das Streben nach Wahrheit und Erkenntnis gehört zum Schönsten, dessen Mensch fähig ist, wenn auch der Stolz auf dieses Streben meist im Munde derjenigen ist, die am wenigsten von solchen Streben erfüllt sind.“

Die Welt ist seit fast einem Jahr mit der Corona-Pandemie beschäftigt. Es wurden sehr viele Maßnahmen getroffen, um die Lage zu kontrollieren. Wir vom DTT Science-Tank Team, haben das Thema Corona-Pandemie nie thematisiert. Der Grund ist ganz einfach. Um sich eine wissenschaftliche Meinung bei einem Thema zu bilden, braucht man gerade in der Wissenschaft einen gesunden und respektvollen Disput. Das haben gute Wissenschaftler immer gemacht. Betrachtet man nur die Geschichte der Quantenphysik und die verschiedene legendäre Fehden zwischen Wissenschaftlern, so lernt  man wie Wissenschaft funktioniert. Leider fand in der jetzigen Corona-Krise kaum eine ordentlicher Disput satt, bis jetzt.

Es muss an der Stelle nicht erwähnt werden, dass die Basis für verschieden Maßnahmen der Regierungen die PCR-Tests darstellen.

Die Anfang 2019 veröffentliche Arbeit: Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR – hier zu finden (https://www.eurosurveillance.org/content/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045)

Autoren:

Victor M Corman, Olfert Landt , Marco Kaiser , Richard Molenkamp4 , Adam Meijer , Daniel KW Chu6 , Tobias Bleicker1 , Sebastian Brünink , Julia Schneider , Marie Luisa Schmidt1 , Daphne GJC Mulders4 , Bart L Haagmans , Bas van der Veer , Sharon van den Brink , Lisa Wijsman, Gabriel Goderski , Jean-Louis Romette, Joanna Ellis, Maria Zambon, Malik Peiris, Herman Goossens , Chantal Reusken, Marion PG Koopmans , Christian Drosten   

ist bekannt. Sie galt und gilt vielleicht noch als der Haupttrigger für die Durchführung von PCR-Tests.

Ohne auf die Einzelheiten der Arbeit einzugehen, würden wir gerne auf einen Review-Report aufmerksam machen:

Bild Quelle: Pixabay

External peer review of the RTPCR test to detect SARS-CoV-2 reveals 10 major scientific flaws at the molecular and methodological level: consequences for false positive results – hier zu finden (https://cormandrostenreview.com/report/)      

Autoren:

Pieter Borger, Bobby Rajesh Malhotra, Michael Yeadon, Clare Crai, Kevin McKernan, Klaus Steger, Paul McSheehy, Lidiya Angelova, Fabio Franchi, Thomas Binder, Henrik Ullrich, Makoto Ohashi, Stefano Scoglio, Marjolein Doesburg-van Kleffens, Dorothea Gilbert, Rainer Klement, Ruth Schruefer, Berber W. Pieksma, Jan Bonte, Bruno H. Dalle Carbonare, Kevin P. Corbett, Ulrike Kämmerer             

      
Es handelt sich bei dem Artikel, um die Übersetzung der wesentlichen Punkte  des Reviews ins Deutsche: Quelle (https://cormandrostenreview.com/report/):

Externes Peer-Review des RT-PCR-Tests zum Nachweis von SARS-CoV-2 offenbart 10 wesentliche wissenschaftliche Mängel auf molekularer und methodischer Ebene: Konsequenzen für falsch positive Ergebnisse.

In der Publikation mit dem Titel "Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR" (Eurosurveillance 25(8) 2020) stellen die Autoren einen diagnostischen Arbeitsablauf und ein RT-qPCR-Protokoll für den Nachweis und die Diagnostik von 2019-nCoV (jetzt bekannt als SARS-CoV-2) vor, von dem sie behaupten, dass es validiert ist und eine robuste diagnostische Methodik für den Einsatz in Public-Health-Labors darstellt. In Anbetracht der Konsequenzen, die sich aus dieser Publikation für Gesellschaften weltweit ergeben, hat eine Gruppe unabhängiger Forscher eine Punkt-für-Punkt-Überprüfung der oben genannten Publikation durchgeführt, bei der

1) alle Komponenten des vorgestellten Testdesigns gegengeprüft wurden,

2) die RT-qPCR-Protokoll-Empfehlungen im Hinblick auf die gute Laborpraxis bewertet wurden

und

3) die Parameter anhand der relevanten wissenschaftlichen Literatur auf diesem Gebiet untersucht wurden.

Das veröffentlichte RT-qPCR-Protokoll zum Nachweis und zur Diagnostik von 2019-nCoV und das Manuskript weisen zahlreiche technische und wissenschaftliche Fehler auf, darunter ein unzureichendes Primerdesign, ein problematisches und unzureichendes RT-qPCR-Protokoll und das Fehlen einer genauen Testvalidierung. Weder der vorgestellte Test noch das Manuskript selbst erfüllen die Anforderungen an eine akzeptable wissenschaftliche Publikation. Weiterhin werden gravierende Interessenkonflikte der Autoren nicht erwähnt. Schließlich deutet die sehr kurze Zeitspanne zwischen Einreichung und Annahme der Publikation (24 Stunden) darauf hin, dass ein systematischer Peer-Review-Prozess hier entweder nicht durchgeführt wurde oder von problematisch schlechter Qualität ist.  Wir liefern überzeugende Belege für mehrere wissenschaftliche Unzulänglichkeiten, Fehler und Mängel.

In Anbetracht der hier präsentierten wissenschaftlichen und methodischen Mängel sind wir zuversichtlich, dass die Redaktion von Eurosurveillance keine andere Wahl hat, als die Veröffentlichung zurückzuziehen.



ZUSAMMENFASSENDER KATALOG DER IM PAPIER GEFUNDENEN FEHLER


Das Corman-Drosten-Papier enthält die folgenden spezifischen Fehler:


1. Es gibt keinen spezifizierten Grund für die Verwendung dieser extrem hohen Konzentrationen von Primern in diesem Protokoll. Die beschriebenen Konzentrationen führen zu erhöhten unspezifischen Bindungen und PCR-Produktamplifikationen, was den Test als spezifisches Diagnoseinstrument zum Nachweis des SARS-CoV-2-Virus ungeeignet macht.


2. Sechs nicht spezifizierte wackelige Positionen führen zu einer enormen Variabilität in den realen Laborimplementierungen dieses Tests; die verwirrende unspezifische Beschreibung im Corman-Drosten-Papier ist nicht als Standard-Arbeitsprotokoll geeignet, was den Test als spezifisches Diagnoseinstrument zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus ungeeignet macht.


3. Der Test kann nicht zwischen dem ganzen Virus und viralen Fragmenten unterscheiden. Daher kann der Test nicht als Diagnostikum für intakte (infektiöse) Viren verwendet werden, wodurch der Test als spezifisches Diagnoseinstrument zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus ungeeignet ist und Rückschlüsse auf das Vorliegen einer Infektion zulässt.


4. Eine Differenz von 10° C in Bezug auf die Annealing-Temperatur Tm für Primerpaar1 (RdRp_SARSr_F und RdRp_SARSr_R) macht den Test ebenfalls ungeeignet als spezifisches Diagnoseinstrument zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus.


5. Ein schwerwiegender Fehler ist das Fehlen eines Ct-Wertes, bei dem eine Probe als positiv und negativ angesehen wird. Dieser Ct-Wert findet sich auch nicht in den Folgeanträgen, was den Test als spezifisches Diagnosewerkzeug zum Nachweis des SARS-CoV-2-Virus ungeeignet macht.


6. Die PCR-Produkte wurden nicht auf molekularer Ebene validiert. Diese Tatsache macht das Protokoll als spezifisches Diagnosewerkzeug zum Nachweis des SARS-CoV-2-Virus unbrauchbar.


7. Der PCR-Test enthält weder eine eindeutige Positivkontrolle, um seine Spezifität für SARS-CoV-2 zu bewerten, noch eine Negativkontrolle, um das Vorhandensein anderer Coronaviren auszuschließen, wodurch der Test als spezifisches Diagnoseinstrument zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus ungeeignet ist.


8. Das Testdesign im Corman-Drosten-Papier ist so vage und fehlerhaft, dass man in Dutzende von verschiedenen Richtungen gehen kann; nichts ist standardisiert und es gibt keine SOP. Dies stellt die wissenschaftliche Validität des Tests stark in Frage und macht ihn als spezifisches Diagnoseinstrument zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus ungeeignet.


9. Höchstwahrscheinlich wurde das Corman-Drosten-Papier nicht peer-reviewed, was den Test als spezifisches Diagnoseinstrument zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus ungeeignet macht.


10. Wir finden schwerwiegende Interessenkonflikte bei mindestens vier Autoren, zusätzlich zu der Tatsache, dass zwei der Autoren des Corman-Drosten Papers (Christian Drosten und Chantal Reusken) Mitglieder des Redaktionsausschusses von Eurosurveillance sind. Am 29. Juli 2020 wurde ein Interessenkonflikt hinzugefügt (Olfert Landt ist Geschäftsführer von TIB-Molbiol; Marco Kaiser ist Senior Researcher bei GenExpress und dient als wissenschaftlicher Berater für TIB-Molbiol), der in der ursprünglichen Version nicht deklariert war (und in der PubMed-Version immer noch fehlt); TIB-Molbiol ist die Firma, die "als erste" PCR-Kits (Light Mix) auf der Basis des im Corman-Drosten-Manuskript veröffentlichten Protokolls herstellte, und nach eigenen Worten diese PCR-Test-Kits schon vor der Publikation vertrieben hat [20]; außerdem haben Victor Corman & Christian Drosten ihre zweite Zugehörigkeit nicht erwähnt: das kommerzielle Testlabor "Labor Berlin". Beide sind dort für die Virusdiagnostik zuständig [21] und die Firma ist im Bereich der Real-Time-PCR-Tests tätig.



SCHLUSSFOLGERUNG


Die Entscheidung, welche Testprotokolle veröffentlicht und allgemein zugänglich gemacht werden, liegt in den Händen von Eurosurveillance. Eine Entscheidung, die Fehler zu erkennen, die in der Corman-Drosten-Studie offensichtlich sind, hat den Vorteil, dass die Kosten und das Leiden von Menschen in Zukunft stark minimiert werden.
Ist es nicht im besten Interesse von Eurosurveillance, dieses Papier zurückzuziehen? Unsere Schlussfolgerung ist klar. Angesichts all der enormen PCR-Protokoll-Designmängel und Fehler, die hier beschrieben werden, kommen wir zu dem Schluss: Im Rahmen der wissenschaftlichen Integrität und Verantwortung bleibt keine große Wahl.



REFERENZEN


[1] Corman Victor M, Landt Olfert, Kaiser Marco, Molenkamp Richard, Meijer Adam, Chu Daniel KW, Bleicker Tobias, Brünink Sebastian, Schneider Julia, Schmidt Marie Luisa, Mulders Daphne GJC, Haagmans Bart L, van der Veer Bas, van den Brink Sharon, Wijsman Lisa, Goderski Gabriel, Romette Jean-Louis, Ellis Joanna, Zambon Maria, Peiris Malik, Goossens Herman, Reusken Chantal, Koopmans Marion PG, Drosten Christian. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020;25(3):pii=2000045. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045


[2] Email communication between Dr. Peter Borger & Dr. Adam Meijer: Supplementary Material


[3] Jafaar et al., Correlation Between 3790 Quantitative Polymerase Chain Reaction–Positives Samples and Positive Cell Cultures, Including 1941 Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Isolates. https://academic.oup.com/cid/advance-article/doi/10.1093/cid/ciaa1491/5912603


[4] BBC, January 21st 2020: https://www.bbc.com/news/world-asia-china-51185836;
Archive: https://archive.is/0qRmZ


[5] Google Analytics – COVID19-deaths worldwide: https://bit.ly/3fndemJ
Archive: https://archive.is/PpqEE


[6] Laboratory testing for COVID-19 Emergency Response Technical Centre, NIVD under
China CDC March 15th, 2020: http://www.chinacdc.cn/en/COVID19/202003/P020200323390321297894.pdf


[7] Real-Time PCR Handbook Life Technologies: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-
handbook.pdf Nolan T, Huggett J, Sanchez E.Good practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR) First Edition 2013


[8] Trestan Pillonel et al, Letter to the editor: SARS-CoV-2 detection by real-time RT-PCR: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7268274/


[9] Kurkela, Satu, and David WG Brown. “Molecular-diagnostic techniques.” Medicine 38.10
(2009): 535-540.


[10] Wolfel et al., Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019
https://www.nature.com/articles/s41586-020-2196-x


[11] Thermofischer Primer Dimer Web Tool: https://www.thermofisher.com/us/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html

[12] Primer-BLAST, NCBI – National Center for Biotechnology Information: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/


[13] Marra MA, Steven JMJ, Caroline RA, Robert AH, Angela BW et al. (2003) Science. The Genome sequence of the SARS-associated coronavirus. Science 300(5624): 1399-1404.


[14] Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate Wuhan-Hu-1, complete genome: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN908947


[15] Borger P. A SARS-like Coronavirus was expected but nothing was done to be prepared. Am J Biomed Sci Res 2020. https://biomedgrid.com/pdf/AJBSR.MS.ID.001312.pdf
https://www.researchgate.net/publication/341120750_A_SARS-like_Coronavirus_was_Expected_but_nothing_was_done_to_be_Prepared;  Archive: https://archive.is/i76Hu


[16] Eurosurveillance paper evaluation / review process: https://www.eurosurveillance.org/evaluation

[17] Official recommendation of the Corman-Drosten protocol & manuscript by the WHO,published on January 13th 2020 as version 1.0 of the document: https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/wuhan-virus-assay-
v1991527e5122341d99287a1b17c111902.pdf; archive: https://bit.ly/3m3jXVH

[18] Official WHO-recommendation for the Corman / Drosten RT-qPCR-protocol, which directly derives from the Eurosurveillance-publication, document-version 2-1, published on
17th January 2020: https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618c_2

[19] Eurosurveillance Editorial Board, 2020: https://www.eurosurveillance.org/upload/site-assets/imgs/2020-09-Editorial%20Board%20PDF.pdf; Archive: https://bit.ly/2TqXBjX

[20] Instructions For Use LightMix SarbecoV E-gene plus EAV Control, TIB-Molbiol & Roche Molecular Solutions, January 11th 2020: https://www.roche-as.es/lm_pdf/MDx_40-0776_96_Sarbeco-E-gene_V200204_09164154001 (1).pdf
Archive, timestamp – January 11th 2020: https://archive.is/Vulo5;  Archive: https://bit.ly/3fm9bXH [21] Christian Drosten & Victor Corman, responsible for viral diagnostics at Labor Berlin:
https://www.laborberlin.com/fachbereiche/virologie/  Archive: https://archive.is/CDEUG

[22] Tom Jefferson, Elizabeth Spencer, Jon Brassey, Carl Heneghan Viral cultures for COVID- 19 infectivity assessment. Systematic review. Systematic review doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.04.20167932 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.08.04.20167932v4

[23] Kim et al.,The Architecture of SARS-CoV-2 Transcriptome: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867420304062

[24] ECDC reply to Dr. Peter Borger, 18th November 2020: Supplementary Material

[25] Prof. Dr. Ulrike Kämmerer & team, survey & Primer-BLAST table